Дейтерированные двойники: как изотопная метка делает анализ лекарств точным

Когда концентрацию лекарства измеряют в плазме крови, ошибка чаще всего возникает не в приборе, а в самой пробе. Белки, фосфолипиды и соли меняют эффективность ионизации, часть вещества теряется при экстракции, и два одинаковых образца дают разный сигнал. Эти искажения можно компенсировать с помощью молекулы-двойника, в которой несколько атомов водорода заменены дейтерием.

Почему нужен внутренний стандарт

В методе ВЭЖХ-МС/МС внутренний стандарт вносят в образец в известном количестве до начала пробоподготовки. Если он ведёт себя так же, как определяемое вещество, отношение их сигналов не меняется при любых потерях. Поэтому реактивы для фармацевтики всё чаще выпускают парами: соединение высокой чистоты и его дейтерированный аналог.

Изотопно-меченая молекула почти не отличается от исходной по полярности и растворимости. Она экстрагируется так же эффективно и выходит из колонки практически одновременно с аналитом, то есть испытывает такое же подавление ионизации. Структурный аналог с другим строением такой точности не даёт.

Масс-спектрометр при этом легко различает двойников: метка d4 сдвигает массу на 4 Да, метка d7 на 7 Да. Обычно хватает сдвига от 3 Да, чтобы природные изотопы аналита не накладывались на сигнал стандарта.

Желчные кислоты и стерины как пример

Урсодезоксихолевую кислоту (УДХК) применяют для растворения холестериновых камней и лечения холестатических заболеваний печени. В фармакокинетических исследованиях и при оценке биоэквивалентности дженериков её определяют в плазме, где она есть и в эндогенном виде. Для этого используют пару: УДХК высокой чистоты служит калибровочным стандартом, а УДХК-d4 с чистотой 99% внутренним.

Так же работают с промежуточными продуктами биосинтеза холестерина. Зимостерол (C27H44O, CAS 128-33-6) и зимостенол (C27H46O, CAS 566-97-2, чистота более 99%) образуются на поздних стадиях этого пути. Для них выпускают меченые формы: зимостерол-d5 и зимостенол-d7.

По профилю этих стеринов видно, какой фермент блокирует препарат. Например, если накапливается зимостенол, подавлена стерол-изомераза. Это учитывают и при поиске новых гиполипидемических средств, и при оценке побочных эффектов. Кетоинтермедиат зимостерон (CAS 27192-37-6) показывает, что происходит на стадии деметилирования.

На что смотреть при выборе стандарта

Первый параметр — изотопная чистота. Остаток немеченой формы d0 в стандарте добавляется к сигналу аналита и завышает результат, особенно на нижней границе диапазона. Поэтому для количественного анализа берут соединения с высокой степенью включения дейтерия.

Второй параметр — положение метки. Дейтерий в гидроксильных и карбоксильных группах, а также рядом с карбонилом может обмениваться с водородом растворителя. Надёжнее метка на углеродном скелете, в положениях, которые не затрагивает пробоподготовка.

Третий параметр — химическая чистота не ниже 99% и у стандарта, и у немеченого вещества. Нужно учитывать и изотопный эффект: если атомов дейтерия много, пик может немного сместиться по времени удерживания. Этот сдвиг проверяют при валидации метода, чтобы убедиться, что матрица влияет на оба соединения одинаково.